吉林农业大学考研(吉林农业大学考研专业目录)

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甲硫氨酸(Met)是一种不能在体内合成而必须由外界获取的人体必需氨基酸,参与生物体内的新陈代谢和蛋白质合成,是多种代谢物质的合成前体。目前微生物发酵法是最有前景生产Met的方法,但是由于生物体内代谢路径多样复杂,各种代谢物质彼此调控,所以该方法尚未完全实现工业化生产。在生物体内,天冬氨酸经过一系列代谢合成Met,而天冬氨酸激酶(AK)是该代谢途径中的第一关键限速酶,其活性同时受赖氨酸(Lys)和苏氨酸(Thr)的协同反馈抑制,导致碳流竞争激烈,Met合成供应减少,使得最终代谢产物Met不能大量积累。

吉林农业大学食品科学与工程学院,小麦和玉米深加工国家工程实验室的樊占青、刘晓婷、闵伟红*等人选择AK催化中心ATP周围5 Å范围内关键残基丝氨酸(Ser227)位点,进行四突变株的构建,筛选获得高酶活力、性状良好的突变株,并结合分子动力学模拟,对其机制进行分析,旨在为优化AK代谢途径提供参考。

1、ATP结合位点的筛选

通过Discovery Studio软件对AK模型分析,Ser227位点是ATP附近5 Å范围内的关键残基;并且利用Clustal X软件进行同源序列比对,Ser227位点是保守位点,如图1所示。

2、突变株构建

PCR产物经1%核酸电泳验证结果如图2A所示,在7 000 bp处有明亮条带,初步证明成功突变。取定量PCR产物经DpnI酶消化后转入大肠杆菌感受态细胞(BL21)中,经过高通量筛选后获得高酶活力突变株。将突变株活化后进行菌液PCR验证,如图2B所示,在1 000~2 000 bp处有明亮单一条带,与目的基因CpAK长度1 266 bp相符,进一步证明目的基因成功大量复制。将筛选的高酶活力突变株送去测序,结果如图2C所示,Ser227位点由残基Ser突变为残基Asp,最终证明突变株T379N/A380C/G171I/S227D构建成功。

3、SDS-PAGE和Western Blot验证

WT菌株和突变株经IPTG诱导表达目的蛋白,分别进行非变性镍柱纯化,将得到的粗酶样和纯化样进行SDS-PAGE和Western Blot验证,结果如图3所示。在48 kDa处有明显条带,证明AK蛋白表达成功。Western Blot验证结果表明,AK蛋白与抗体(His-tag27E8 Mouse mAb)特异性结合,纯化样是单一AK蛋白。

4、酶动力学分析

测定结果用Origin 9.0软件进行非线性拟合,根据Hill方程V=V max S n /(K n +S n )得到WT和突变株的最大催化速率V max 。动力学结果见图4、表1,该突变株T379N/A380C/G171I/S227D的K m 值减小为1.35 mmol/L,底物亲和力增大,利于AK与底物的结合,从而提高其催化效率;V max 值为242.05 U/(mg·min),较T379N/A380C/G171I(187.88 U/(mg·min))提高到1.28 倍,较WT AK( 3.01 U/(mg·min))提高到80.41 倍,表明突变后AK的催化活力显著提高。

5、酶学性质表征

最适温度

由图5A可知,WT AK最适催化温度25 ℃,T379N/A380C/G171I AK最适催化温度28 ℃,该突变株T379N/A380C/G171I/S227D最适催化温度30 ℃,较WT和T379N/A380C/G171I分别提高5 ℃和2 ℃,表明突变增强了AK的耐热性,有效提高了AK的最适温度。当温度高于30 ℃后,该突变株的酶活力仍然较高于WT和T379N/A380C/G171I,说明多次突变有利于AK的耐高温性能的优化。

最适pH值

由图5B可知,WT AK最适pH值为8.0,T379N/A380C/G171I AK最适pH值为9.0,该突变株T379N/A380C/G171I/S227D最适pH值为8.5。与T379N/A380C/G171I相比,该突变株最适pH值降低0.5,耐酸性提高,同时,pH值耐受范围变大,这可能是Ser227位点由中性氨基酸Ser突变为酸性氨基酸Asp的缘故。在pH值为10时,该突变株的酶活力仍然保持在32%,较高于WT和T379N/A380C/G171I。

AK稳定性

相对酶活力下降到最初活力50%所用时间为酶的半衰期。选择最适温度和最适pH值,分别研究WT和突变株的稳定性。如图5C所示,WT AK的半衰期为4.9 h,而T379N/A380C/G171I AK的半衰期为3.1 h,该突变株T379N/A380C/G171I/S227D的半衰期为3.9 h。与WT AK相比,该突变体AK在反应初(0~3 h)和反应末(7~10 h)相对酶活力显著高于WT AK。与T379N/A380C/G171I AK相比,该突变株AK半衰期延长0.8 h,且相对酶活力几乎始终高于T379N/A380C/G171I AK。

底物抑制剂对AK活力的影响

由表2可知,WT AK受Thr和Lys两种抑制剂的协同反馈抑制,而Met对其抑制作用相对较弱。随着Thr和Lys浓度的增加,抑制作用明显增强,当Lys浓度增加到10 mmol/L时,对WT AK的抑制率大约达到39%。当两种抑制剂组合浓度为10 mmol/L时,WT AK抑制率最高为45.04%。当3种抑制剂组合浓度为10 mmol/L时,WT AK 抑制率仅比Lys+Thr组合时高4.15%,再次说明AK受Met抑制作用相对较弱,而主要受Thr和Lys的抑制。

6、突变体的空间结构分析

以构建的AK模型为基础,通过Discovery Studio软件对Ser227位点突变前后与ATP和其周围残基的作用力以及距离变化进行分析。如图6A、B所示,突变前Ser227残基与ATP及周围氨基没有直接作用,突变后,S227D残基侧链向ATP延伸,与ATP和I229残基产生氢键,氢键占有率增加,连接更加紧密,更容易促进催化反应发生,这与Han Caijing等研究报道一致;如图6C、D所示,突变前Ser227残基与ATP距离为2.953 Å,突变后距离缩短为2.562 Å。突变后,距离缩短,作用力增强,从而提高酶活力。

7、分子动力学模拟

如图7A所示,复合物主链C骨架RMSD平均值为0.90 nm,体系在19 ns处达到平衡界点,之后一直平衡稳定于0.9 nm左右,说明体系在整个模拟过程中始终保持稳定状态。R g 是在模拟过程中根据整个蛋白体积和性状计算出的蛋白回旋半径,反映了体系在模拟过程中的柔韧性,如图7B所示,复合物在整个模拟过程中基本平稳,平均R g 收敛于26.66 Å,整个体系柔韧性良好,这可能是由于突变使得蛋白结构发生重排趋于稳定状态。蛋白表面溶剂可及表面积(SASA)是描述蛋白质亲疏水性的重要参数,对蛋白的空间构象及其稳定性具有重要意义,由图7C可知,复合物的模拟轨迹没有较大波动,一直保持平稳,整个模拟过程平均SASA值为222.56 nm 2 ,表明突变使得T379N/A380C/G171I/S227D 的亲水性增强,蛋白表面溶剂的亲和能力增强,从而影响其催化活性,这可能是由于突变后Asp残基侧链像ATP延伸,同时形成氢键。以上3个参数都是在蛋白质整体上进行分析研究,而均方根波动(RMSF)是从整个模拟催化过程单个氨基酸残基的相对波动情况进行分析。由图7D可知,整个模拟过程中,复合物体系都表现出很好的灵活性,利于催化反应。

结 论

本研究对CpAK中催化域ATP周围关键残基Ser227位点进行定点饱和突变,以达到减弱或解除抑制,酶活力显著提高并获得优良多突变株的目的。通过软件Primer Premier 5 进行突变引物设计,以T379N/A380C/G171I AK为模板,经1%核酸电泳验证,成功构建突变株T379N/A380C/G171I/S227D。并将其转入宿主大肠杆菌BL21表达,经SDS-PAGE和Western Blot验证AK成功表达。动力学分析结果表明,该突变株的Vmax较T379N/A380C/G171I提高到1.28 倍,较WT AK提高到80.41 倍,酶活力显著提高,并且与底物的亲和力也明显增大,有利于与底物的结合。酶学性质研究表明:该突变株T379N/A380C/G171I/S227D的最适反应温度增至30 ℃,较WT和T379N/A380C/G171I分别提高5 ℃和2 ℃;最适pH值为8.5,较T379N/A380C/G171I(pH 9.0)减小0.5;半衰期为3.9 h,较T379N/A380C/G171I延长0.8 h;且在不同浓度、不同组合抑制剂存在时,该突变株表现出明显的激活作用,抑制效果减弱显著,相对酶活力最高达143.35%,这与动力学结果相符。同时分子动力学模拟从个体和单个氨基酸残基的变化,其中包括氢键的形成以及复合物系统中的分子间作用力,对酶活力提高进一步说明,为构建高产工程菌提供参考。

本文《新型天冬氨酸激酶突变株构建及酶学性质表征》来源于《食品科学》2022年43卷2期62-69页,作者:樊占青,刘晓婷,魏贞,王哲人,王亚南,高欣,闵伟红。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201126-276。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑:袁艺;责任编辑:张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网。

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