四川轻化工大学研究生(四川轻化工大学研究生院)
四川轻化工大学研究生，四川轻化工大学研究生院
浓香型大曲在发酵过程中微生物、微生物和代谢产物之间呈一种动态、有规律的演变过程，并通过微生物代谢产生多种代谢产物和风味物质，研究表明吡嗪类物质是促进白酒特定风味形成的决定性风味物质之一。其中2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪有助于浓香型白酒的呈香，并具有扩张血管、改善血循环、护肝等功能。虽然已从大曲中鉴定出多种吡嗪类化合物，但关于吡嗪类物质与浓香型大曲发酵过程中微生物群落的相关性仍不清楚，对大曲发酵过程中吡嗪类物质的合成机制尚不完全清楚。
四川轻化工大学 酿酒生物技术及应用重点实验室的陈莹琪、黄 丹*等利用高通量测序技术全面系统地解析浓香型大曲发酵过程微生物群落结构的变化，并通过HS-SPME-GC-MS测定大曲发酵过程中吡嗪类物质的种类、含量，解析制曲过程中吡嗪类物质合成的阶段性特征，以及吡嗪类物质与大曲微生物的相关性，揭示吡嗪类物质相关微生物与大曲发酵过程中其他微生物的共生网络，旨在为解析大曲发酵过程中的吡嗪类物质的合成机制提供参考。
1、浓香型大曲发酵过程中吡嗪类物质的变化
在大曲发酵过程中，通过HS-SPME-GC-MS共检测到9 种吡嗪类物质，含量如图1a所示。在检测到的9 种吡嗪类物质中，具有主要贡献作用的是2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪，这与韩素娜等的研究类似。在大曲发酵1～5 d时，吡嗪类物质总含量极低，随着发酵的进行，吡嗪类物质总含量存在2 个快速增长阶段：7～9、18～22 d，分别增加到3.8、2.1 倍。其中2,3,5,6-四甲基吡嗪在发酵7～9 d增加到3.6 倍，2,3,5-三甲基吡嗪在发酵7～9 d增加到3.7 倍。在18 d，吡嗪类物质含量大幅降低，这可能是因为在15～18 d时大曲发酵温度相对较高，吡嗪类物质具有挥发性而造成了散逸；再有就是微生物将其作为底物而被转化。与大曲发酵前相比，大曲发酵结束后2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪等吡嗪类物质含量均明显增加。
风味Heatmap图可以直观地反映大曲发酵过程中9 种吡嗪类物质的变化和差异（图1b）。对大曲发酵过程中吡嗪类物质进行聚类分析，发现可以分为两个阶段：1～5、7～28 d。其中，在1～5 d阶段，3～5 d的吡嗪类物质可以聚为一个小类；在7～28 d阶段，7～9、13～15、22～28 d的吡嗪类物质可以分别聚为一个小类，并且7～15 d和18～28 d又可以单独聚为一类。说明在7～28 d阶段，吡嗪类物质组成和含量相对较为相似，与1～5 d阶段相比有一定差异。这可能是因为在制曲过程中，发酵不同阶段大曲微生物菌群结构不同，大曲微生物所处的发酵温度有差异，从而影响了吡嗪类物质的合成和积累，因此产生的吡嗪类物质的含量与数量较1～5 d阶段多。
2、浓香型大曲发酵过程中优势微生物的群落演替
大曲发酵过程中优势真菌属（平均相对丰度＞1%）的变化情况如图2a所示。大曲发酵过程中各阶段的优势真菌差异较大。在大曲发酵1～5 d时，优势真菌群落主要是奥默柯达属（Kodamaea）、伊萨酵母属（Issatchenkia）、念珠菌属（Candida）、曲霉属（Aspergillus）等，相对丰度分别为76.04%～31.20%、41.84%～9.83%、34.34%～4.03%、7.64%～1.77%。此外，双足囊菌属（Dipodascus）、地丝菌属（Geotrichum）等也占据一定比例，这些微生物也是大曲发酵前期的优势微生物。随着发酵进程的推移，以嗜热子囊菌属（Thermoascus）、嗜热丝孢菌属（Thermomyces）为代表的嗜热真菌属逐渐占据微生物群落丰度的优势地位。大曲发酵7～13 d，嗜热子囊菌属、伊萨酵母属、假丝酵母属（Candida）等为优势真菌属，嗜热子囊菌属占优势地位，在发酵中期11 d，嗜热子囊菌属在群落中的占比高达98.25%；在发酵的后期15～28 d，嗜热子囊菌属、嗜热丝孢菌属占有绝对优势，可以占群落相对丰度的99%以上。
大曲发酵过程中优势细菌属（平均相对丰度＞1%）的变化情况如图2b所示。在大曲发酵的整个阶段芽孢杆菌属（Bacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）相对丰度均占据优势地位。在1～5 d阶段，芽孢杆菌属在细菌中的占比逐渐升高，相对丰度从30.96%升为49.25%；而魏斯氏菌属在细菌中的占比逐渐降低，相对丰度从43.11%降至15.51%。大曲发酵5 d后，芽孢杆菌属的丰度呈波动上升后稳定的趋势，且在细菌中占有绝对优势；而魏斯氏菌属则呈波动下降后稳定的趋势。
3、浓香型大曲发酵过程中微生物群落的组成比较
真菌群落在A阶段和B阶段距离较远（图3a），说明在发酵A阶段和发酵B阶段的真菌群落结构差异较大，这与大曲微生物群落组成和吡嗪类物质分析一致；B阶段中的点比A阶段分布更广，表明真菌群落在发酵B阶段变化可能高于发酵A阶段。与真菌群落不同的是，细菌群落在A阶段和B阶段出现了大部分的重叠（图3b），说明它们之间的差异并不明显。
LEfSe多重分析表明（图4），有显著差异的真菌属共有38 种（线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）值＞2，P＜0.05）（图4a），包括A阶段奥默柯达属（Kodamaea）、念珠菌属（Candida）、伊萨酵母属（Issatchenkia）等33 个真菌属；B阶段由嗜热子囊菌属（Thermoascus）、嗜热丝孢菌属（Thermomyces）、链格孢属（Alternaria）等5 个真菌类群表现出明显的属间差异。
与真菌不同的是，细菌有显著差异的属共有36 种（LDA＞2，P＜0.05）（图4b），且差异细菌属大多在B阶段。在A阶段的差异细菌属共12 种，包括考萨考氏菌属（Kosakonia）、泛菌属（Pantoea）、嗜甲基菌属（Methylophilus）等；在B阶段，共有24 种差异细菌属，包括高温放线菌属（Thermoactinomyces）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、不动杆菌（Acinetobacter）等。
4、浓香型大曲发酵过程微生物群落与吡嗪类物质的相关性分析
差异微生物与吡嗪类物质的相关性Heatmap和共生网络图分析
由图5a可知，2-乙烯基-6-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪与多种差异真菌（属）都呈正相关；而2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪、2-甲基吡嗪则与多种差异真菌（属）呈负相关。与吡嗪类物质具有相关性的38 种差异真菌（属）中（Spearman相关系数|ρ|＞0.6），仅13 种真菌表现出与吡嗪类物质具有显著相关性（P＜0.005），如图5c所示，2-乙烯基-6-甲基吡嗪与刺孢壳属（Chaetomella）呈非常显著正相关，2,5-二甲基吡嗪仅与刺孢壳属呈正相关；2,6-二甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪则仅与枝孢霉属（Cladosporium）呈正相关；2,3-二甲基吡嗪则与多数真菌（枝孢霉属、横梗霉属（Lichtheimia）、小尖霉属（Microtrichum）等）呈显著正相关；2-乙基-6-甲基吡嗪与刺孢壳属、横梗霉属等呈显著正相关。然而，2-乙基-6-甲基吡嗪与嗜热丝孢菌属呈显著负相关，2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪与刺孢壳属、镰刀菌属（Fusarium）呈显著负相关。
由图5b可知，2-乙烯基-6-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪等与多数的差异细菌（属）呈负相关，2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪则表现出和大部分差异细菌（属）呈正相关。共36 种细菌（属）表现出与吡嗪类物质之间的关联性（|ρ|＞0.6），但仅有8 种细菌与吡嗪类物质具有显著相关性（P＜0.005），如图5d所示，2,3,5-三甲基吡嗪与球形芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、涅瓦菌属（Nevskia）、未分类肠杆菌属（unclassified_o_Enterobacterales）显著正相关，2-乙烯基-6-甲基吡嗪与Pelomonas呈非常显著正相关，2-甲基吡嗪与unclassified_f__Candidatus_Hepatincola呈正相关。除此之外，2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪与泛菌属具有显著负相关，2-乙基-6-甲基吡嗪与诺卡菌属、未分类乳杆菌属（unclassified_o_Lactobacillales）呈显著负相关，与泛菌属则表现出正相关。同时，2,6-二甲基吡嗪与诺卡菌属（Nocardia）、未分类乳杆菌属呈负相关。
浓香型大曲发酵过程微生物与吡嗪类物质相关微生物的相关性网络分析
结果显示，真菌属相关性网络（图6a）由88 个节点、443 条边连接而成。节点间以正相关（89.84%）为主，只有少数是负相关（10.16%），枝孢霉属与13.93%的真菌属具有相关性，其中与大多数真菌属呈正相关，而仅与嗜热子囊菌属（Thermoascus）和未分类散囊菌目（unclassified_o_Eurotiales）两种真菌属呈负相关；除此之外，刺孢壳属（Chaetomella）、伊萨酵母属（Issatchenkia）、镰刀菌属（Fusarium）、毕赤醇母属（Pichia）分别与6.29%、8.31%、6.74%、5.62%的真菌属具有相关性，且与其中大多数的真菌呈正相关，与极少数的真菌呈负相关。相反的是，嗜热真菌属（Thermomyces）与7.86%的真菌属具有相关性，但却与大多数的真菌属呈负相关，表明嗜热真菌属与大多数属之间存在共排斥关系。值得注意的是，小尖霉属（Wallemia）仅与Wickerhamomyces这一种真菌属具有相关性，呈正相关。
细菌属相关性网络（图6b）由88 个节点、161 条边连接而成。节点间以正相关达67.70%。泛菌属（Pantoea）与20.49%的细菌属具有相关性，其中与大多数细菌属呈负相关，而仅与魏斯氏菌属（Weissella）、链球菌属（Streptococcus）呈正相关；与之相反的是，诺卡菌属（Nocardia）、unclassified_f__Candidatus_Hepatincola、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）分别与19.87%、11.80%、10.56%的细菌属具有相关性，且与其中大多数的细菌呈正相关，与极少数细菌呈负相关。涅瓦河菌属（Nevskia）、Pelomonas分别与8.07%、4.35%的细菌属具有相关性，且表现为共合作关系。
结论
结果显示，在制曲过程中共检测到9 种吡嗪类物质，在1～5 d和7～28 d阶段吡嗪类物质的数量和种类存在显著差异，且制曲过程中微生物群落演替可分为两个阶段：A阶段（1～5 d）和B阶段（7～28 d）。在A阶段，差异真菌主要为奥默柯达属（Kodamae）、念珠菌属（Candida），差异细菌主要为考萨考氏菌属（Kosakonia）、泛菌属（Pantoea）、嗜甲基菌属（Methylophilus）；B阶段差异真菌主要为嗜热子囊菌属（Thermoascus）、嗜热丝孢菌属（Thermomyces），差异细菌主要为高温放线菌属（Thermoactinomyces）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）。制曲过程中与吡嗪类物质合成呈正相关的微生物包括枝孢霉属（Cladosporium）、横梗霉属（Lichtheimia）等；呈负相关的微生物包括嗜热子囊菌属、镰刀菌属（Fusarium）等，这些吡嗪合成相关微生物与制曲过程中其他大曲微生物之间多呈正相关，仅嗜热真菌属（嗜热子囊菌属）等少数微生物表现出负相关。研究结果揭示了浓香型大曲发酵过程中合成吡嗪类物质相关的微生物菌群，为解析大曲微生物合成吡嗪类物质的机制提供理论依据。
通信作者简介
01
黄丹，教授，1989年毕业于四川轻化工学院食品工程系，研究方向为酿造微生物及其应用。1989年7月至2001年6月就职于自贡市轻工业设计研究院，2001年6月至今任教于四川理工学院，2002年3月至7月于四川大学生命科学院进修。主要承担本科及研究生课程《微生物学》、《微生物实验技术》、《微生物菌种选育实验》、《食品发酵分析实验》及《高级微生物学》的理论和实践教学工作，四川理工学院精品课程《微生物学》负责人。近年来发表科研论文40余篇，三大检索收录4篇，主持、主研省部级课题十余项，横项课题4项，授权专利6项，出版教材4部，内部讲义3部。荣获四川省、自贡市级科技进步奖、学校教学十佳、优秀教师、师德建设先进个人等各种奖励十余次。
第一作者简介
02
陈莹琪，四川轻化工大学食品工程研究生，研究方向为白酒酿造微生态。主要研究微生物强化在白酒酿造中的作用。
本文《浓香型大曲微生物菌群演替与吡嗪类物质合成的关系》来源于《食品科学》2023年44卷2期222-230页，作者：陈莹琪，陈杰，周耀进，李子健，唐世超，赵玉川，罗惠波，黄丹。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220225-224。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
图片来源于文章原文及摄图网。
为构建多元化食物供给体系并兼顾生态环境保护，并形成以生物多样性保护促进食品生产的可持续性，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与北方民族大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院于 2023年5月13-14日在中国宁夏银川 共同举办“ 生态保护与食品可持续发展国际研讨会 ”。本届研讨会将围绕新资源食品挖掘、动植物、微生物可替代蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要创新进展及存在的问题开展研讨，探讨未来食品发展方向，通过展示我国生态保护与食品可持续发展等领域的最新科研成果，搭建科研单位与企业产学研结合的平台，共同促进我国食品产业发展快速踏入新里程。
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
四川轻化工大学研究生(四川轻化工大学研究生院)